為了對(dui)以個特定序列進行(xing)PCR做重復檢測,需(xu)要三(san)個不同的區(qu)域,每(mei)一個區(qu)域的具(ju)體技術操作(zuo)和試劑在下面詳(xiang)細列出

　　1、樣品準備區

　　這個區域專門用作樣品(pin)的(de)準備，在制備和操作用于(yu)核酸提取(qu)的(de)試(shi)劑時應該采

　　取預防措施：

　　1)PCR產物和帶有要擴(kuo)增序列的DNA克(ke)隆不能(neng)在這個房間操作。

　　2)組(zu)織培養物、組(zu)織標本和血清樣(yang)品都(dou)帶(dai)進(jin)樣(yang)品準備間處理，以根(gen)據(ju)應(ying)用(yong)的需要提(ti)取DNA或RNA。

　　3)用于(yu)樣(yang)品處理的工(gong)具不能被用作(zuo)普通分子克(ke)隆的工(gong)具，也不能用作(zuo)操作(zuo)靶序列。

　　4)DNA樣品應該(gai)用(yong)有專門的防護或(huo)正(zheng)壓活塞式(shi)移液管操作，以防止(zhi)在吸取樣品時有氣溶膠遺留(liu)。

　　5)大體積樣(yang)品(pin)應該用單獨包裝的無菌一次性移(yi)液管吸取(qu)。

　　6)管子打開前(qian)都要簡短離(li)心以減少氣(qi)溶膠(jiao)的產(chan)生，而(er)且管子不能用(yong)力崩開，這樣(yang)會產(chan)生氣(qi)溶膠(jiao)。

　　7)任何時候都應該穿實(shi)驗(yan)服(fu)和(he)帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步(bu)之(zhi)間都要更換。實(shi)驗(yan)服(fu)要專門用于樣品準備(bei)間，經常清洗(xi)。

　　2、樣品準備和RNA-PCR

　　RNA-PCR的(de)(de)額外(wai)步驟需要額外(wai)的(de)(de)樣(yang)(yang)品操作，這(zhe)樣(yang)(yang)增加了樣(yang)(yang)品之間(jian)污染的(de)(de)機會。

　　3、前(qian)PCR區

　　必(bi)須(xu)(xu)有專門用(yong)于(yu)(yu)準(zhun)備各種反應的區(qu)(qu)域，這個(ge)區(qu)(qu)域必(bi)須(xu)(xu)保持干凈(jing)，而(er)且沒有來(lai)自克(ke)隆和樣品準(zhun)備的污(wu)染(ran)。前(qian)PCR區(qu)(qu)必(bi)須(xu)(xu)要(yao)有試劑和準(zhun)備，特別是專門用(yong)于(yu)(yu)前(qian)PCR區(qu)(qu)的正(zheng)壓活塞式移液管(guan)。

　　4、PCR實驗(yan)室(shi)試劑(ji)的操作

　　1)所(suo)用的所(suo)有(you)溶液都應該沒有(you)核酸(suan)(suan)和(或)核酸(suan)(suan)酶(DNase和RNase)污(wu)染。

　　2)所有PCR試劑中使(shi)用的(de)水都應該是(shi)高(gao)質量(liang)的(de)-新鮮(xian)蒸餾的(de)去離子水，用0.22μm過濾的(de)，并且是(shi)高(gao)壓滅菌。

　　3)在20℃到25℃貯存的試劑(ji)建議加點像疊氮(dan)(dan)鈉一類的抗微(wei)生物劑(ji)，在擴(kuo)增試劑(ji)或樣品制備試劑(ji)中加入0.025%的疊氮(dan)(dan)鈉不(bu)抑制擴(kuo)增反應。

　　4)所用試(shi)劑(ji)都應該以(yi)大(da)體積(ji)配制，實驗一下看試(shi)劑(ji)是否滿意，然后分裝(zhuang)成僅夠(gou)一次使用的量進行貯(zhu)存。

　　5)所有試劑和樣品準備過程(cheng)中都要使用一次性(xing)滅菌的瓶子(zi)和管子(zi)。

　　6)新(xin)配制的(de)試劑在用于準備新(xin)的(de)標本之前(qian)應該加以(yi)檢驗。

　　7)樣(yang)品準備(bei)和前PCR區所(suo)使用的移(yi)液管(guan)在不(bu)使用時都(dou)應該小(xiao)心保存。

　　5、在前PCR區(qu)建立(li)PCR混合物(wu)

　　1)可(ke)以把即刻可(ke)用的“主(zhu)混合物”溶液(ye)配好、分裝并保(bao)存在(zai)-20℃或4℃，在(zai)實驗室(shi)只涉及到擴增一種(zhong)或少數(shu)幾種(zhong)特(te)異(yi)序列(lie)時這樣做(zuo)很有(you)用。

　　2)如果你的(de)(de)實(shi)驗室使用多套引物，以(yi)致(zhi)于配制包括所有試劑(ji)的(de)(de)單一(yi)反(fan)應混合物不夠經濟，可以(yi)考慮分(fen)(fen)裝保存夠一(yi)天(tian)的(de)(de)PCR成分(fen)(fen)。

　　3)作為(wei)一個規則(ze)，應該(gai)保存一套(tao)陰性(xing)、弱陽(yang)性(xing)和強陽(yang)性(xing)對照樣(yang)(yang)品(pin)來分(fen)析樣(yang)(yang)品(pin)配制(zhi)和PCR前過(guo)程(cheng)的(de)效率(lv)和潔凈程(cheng)度(du)。而(er)且，你也希望(wang)通過(guo)使用一個已知(zhi)的(de)弱陽(yang)性(xing)樣(yang)(yang)品(pin)來驗證(zheng)你的(de)樣(yang)(yang)品(pin)緩(huan)沖液以證(zheng)明里(li)面不含擴增抑制(zhi)物。