為(wei)了對以個(ge)特(te)定序(xu)列進行PCR做(zuo)重(zhong)復檢(jian)測(ce)，需要三個(ge)不(bu)同的(de)區(qu)域(yu)，每一個(ge)區(qu)域(yu)的(de)具體技術操作和試劑在下面詳細列出。

　　1、樣品準備區

　　這個區域(yu)專(zhuan)門(men)用(yong)作樣品的準備，在(zai)制備和操作用(yong)于(yu)核酸提取(qu)的試劑時(shi)應該采取(qu)預防措施：

　　1)PCR產物和帶(dai)有要擴(kuo)增序列的DNA克隆(long)不能在這(zhe)個房間操作。

　　2)組織培養物、組織標本(ben)和血清樣(yang)品都帶進樣(yang)品準備間處理，以根據應用的(de)需要提取DNA或RNA。

　　3)用(yong)于樣品(pin)處理的工具(ju)不(bu)能(neng)被用(yong)作普通分(fen)子克隆的工具(ju)，也不(bu)能(neng)用(yong)作操作靶序列。

　　4)DNA樣品應該用有(you)專門的防護或正壓活塞式移液管操作(zuo)，以防止(zhi)在吸取樣品時有(you)氣溶(rong)膠遺(yi)留。

　　5)大體積樣(yang)品應(ying)該用單獨包裝的無菌一次性移(yi)液管吸取。

　　6)管子(zi)打(da)開前都(dou)要簡短離(li)心以(yi)減(jian)少氣(qi)溶膠的產(chan)(chan)生(sheng)，而且(qie)管子(zi)不能(neng)用(yong)力崩開，這樣會(hui)產(chan)(chan)生(sheng)氣(qi)溶膠。

　　7)任何時候都應該穿實驗服(fu)和帶手套(tao)，手套(tao)要經(jing)常更換，尤其(qi)在抽提(ti)過程中(zhong)每一步之間都要更換。實驗服(fu)要專門用于樣(yang)品準備間，經(jing)常清洗。

　　2、樣品準(zhun)備和RNA-PCR

　　RNA-PCR的(de)額外(wai)步驟需要額外(wai)的(de)樣(yang)(yang)品操作，這樣(yang)(yang)增加了(le)樣(yang)(yang)品之間污染的(de)機(ji)會。為了(le)避免這一問(wen)題，反轉錄一步可以(yi)在樣(yang)(yang)品準備(bei)區進(jin)行(xing)。在RNA-PCR中(zhong)應用(yong)UNG以(yi)防(fang)止污染的(de)方法也有報(bao)道。

　　3、前PCR區

　　必(bi)須(xu)有(you)專(zhuan)門(men)用于(yu)準(zhun)備(bei)各種(zhong)反應的(de)區(qu)域，這個區(qu)域必(bi)須(xu)保持(chi)干凈(jing)，而且沒(mei)有(you)來(lai)自(zi)克(ke)隆和(he)樣品準(zhun)備(bei)的(de)污染。前PCR區(qu)必(bi)須(xu)要有(you)試劑和(he)準(zhun)備(bei)，特別是專(zhuan)門(men)用于(yu)前PCR區(qu)的(de)正壓活(huo)塞式移液管。

　　4、PCR實驗室試劑的操作

　　1)所用的所有溶液(ye)都應該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

　　2)所有PCR試劑中使用的(de)水(shui)都應該是(shi)高質量的(de)-新鮮蒸餾(liu)的(de)去離(li)子水(shui)，用0.22μm過濾的(de)，并(bing)且是(shi)高壓滅(mie)菌。

　　3)在20℃到25℃貯存的試劑建(jian)議加點像(xiang)疊氮鈉一類的抗(kang)微生物劑，在擴(kuo)增試劑或(huo)樣品制(zhi)備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制(zhi)擴(kuo)增反應。

　　4)所用試劑都應該以大體積配制，實驗一(yi)下看(kan)試劑是否滿意，然后分裝(zhuang)成僅夠(gou)一(yi)次使用的(de)量(liang)進(jin)行貯存(cun)。

　　5)所有試劑和樣(yang)品準(zhun)備(bei)過程中都(dou)要使(shi)用一次性(xing)滅菌的瓶子和管子。

　　6)新配制(zhi)的試劑在用于(yu)準備新的標本之前(qian)應該加以檢驗。

　　7)樣品準備和前PCR區所使用的移(yi)液(ye)管在不(bu)使用時都應(ying)該小(xiao)心(xin)保存。

　　5、在前PCR區建立PCR混合(he)物

　　1)可(ke)以把即(ji)刻可(ke)用的“主混合物(wu)”溶液配好、分裝并保存在(zai)-20℃或4℃，在(zai)實驗室只涉及(ji)到(dao)擴(kuo)增一種或少數(shu)幾種特異序列時這樣做很有用。

　　2)如果(guo)你(ni)的實驗室使(shi)用多套引物，以致于配(pei)制包括所有試劑的單一(yi)反應混合物不夠(gou)經濟(ji)，可以考慮分裝保存夠(gou)一(yi)天的PCR成分。

　　3)作為一(yi)個規則(ze)，應該保(bao)存(cun)一(yi)套陰性(xing)、弱陽(yang)性(xing)和(he)(he)強陽(yang)性(xing)對照樣品來(lai)分析樣品配制和(he)(he)PCR前過程的(de)效率和(he)(he)潔凈程度。而且，你也希(xi)望(wang)通過使用一(yi)個已知的(de)弱陽(yang)性(xing)樣品來(lai)驗證你的(de)樣品緩沖液以(yi)證明里面不含擴增抑制物。

　　4)陰(yin)性樣品(pin)(pin)要與每組樣品(pin)(pin)同時(shi)做，以(yi)分析是否存(cun)在樣品(pin)(pin)與樣品(pin)(pin)之間的(de)污染以(yi)及(ji)是否存(cun)在PCR產物的(de)污染，陰(yin)性對照(zhao)應該(gai)包(bao)括核酸(suan)以(yi)外的(de)所有試劑。

　　5)當做陽性對照時，有兩(liang)個理由決定了(le)應該使用最少(shao)數量的核酸。

　　6)由于(yu)必須有對照反應(ying)，對照模板的(de)特(te)點應(ying)該(gai)予以考慮。

　　6、控制污染(ran)的(de)方法(fa)

　　已設(she)計出很有力的(de)(de)(de)酶學方(fang)法用來消除(chu)(chu)一種形式的(de)(de)(de)污染(ran)—使用UNG，這(zhe)一技術能有效地消除(chu)(chu)由PCR產物(wu)引起(qi)的(de)(de)(de)污染(ran)。另一種控制污染(ran)的(de)(de)(de)方(fang)法是使用紫外線，這(zhe)種方(fang)法不能完全消除(chu)(chu)污染(ran)問題，但(dan)可以(yi)將污染(ran)降低幾(ji)個數(shu)量(liang)級。

　　7、PCR儀的位置

　　8、后PCR區(qu)

　　PCR完成以后(hou)，需要分析樣品(pin)并解釋數據，應該留(liu)出一(yi)個專門用(yong)(yong)(yong)于(yu)反應后(hou)處理樣品(pin)的(de)地方。后(hou)PCR活動(dong)中使用(yong)(yong)(yong)的(de)所用(yong)(yong)(yong)試(shi)劑、一(yi)次性耗材和儀器都必須是專門用(yong)(yong)(yong)于(yu)這(zhe)一(yi)目(mu)的(de)，決不能把實驗室這(zhe)一(yi)區域的(de)試(shi)劑或儀器用(yong)(yong)(yong)于(yu)任何(he)前PCR活動(dong)。